ПРОЦЕСС СОЗДАНИЯ CAR-T ЛИМФОЦИТОВ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В ЛЕЧЕНИИ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

УДК 615.37 Абаева Вероника Анатольевна, студентка 5 курса лечебный факультет Северо-Осетинская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения Российской Федерации Россия, г. Владикавказ e-mail: abaeva.veronika99@mail.ru Кантемирова Луиза Арислановна студентка 5 курса лечебный факультет Северо-Осетинская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения Российской Федерации Россия, г. Владикавказ Абдуллаев Рустам Мурадович студент 5 курса лечебный факультет Северо-Осетинская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения Российской Федерации Россия, г. Владикавказ Научный руководитель: Кокаев Ромеш Иванович, кандидат медицинских наук, доцент, Северо-Осетинская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения Российской Федерации Россия, г. Владикавказ ПРОЦЕСС СОЗДАНИЯ CAR-T ЛИМФОЦИТОВ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В ЛЕЧЕНИИ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ Аннотация: В статье представлены методы создания и способы культивирования CAR-T лимфоцитов, используемых в лечении разных видов онкологических заболеваний. Несмотря на преимущества адоптивной иммунотерапии Т-клетками, существует вероятность развития нежелательных эффектов от проводимого лечения, в связи с чем необходимы новые методы модификаций, которые помогут улучшить качество терапии и снизить количество побочных эффектов. Ключевые слова: CAR-T, лимфоциты, адоптивная иммунотерапия, онкология. Abaeva Veronika Anatolyevna 1 Журнал «Трибуна ученого» Выпуск 03/2022 https://tribune-scientists.ru 5th year student Medical Faculty North Ossetian State Medical Academy of the Ministry of Health of the Russian Federation Russia, Vladikavkaz, Kantemirova Luiza Arislanovna 5th year student Medical Faculty North Ossetian State Medical Academy of the Ministry of Health of the Russian Federation Russia, Vladikavkaz, Abdullaev Rustam Muradovich 5th year student Medical Faculty North Ossetian State Medical Academy of the Ministry of Health of the Russian Federation Russia, Vladikavkaz, Scientific adviser Kokaev Romesh Ivanovich, candidate of medical sciences, associate professor, North Ossetian State Medical Academy of the Ministry of Health of the Russian Federation Russia, Vladikavkaz THE PROCESS OF CREATION OF CAR-T LYMCOCITES AND THEIR APPLICATION IN THE TREATMENT OF ONCOLOGICAL DISEASES Abstract: The article presents methods for creating and culturing CAR-T lymphocytes used in the treatment of various types of cancer. Despite the advantages of adoptive T-cell immunotherapy, there is a potential for undesirable effects from the treatment, and therefore new modification methods are needed to help improve the quality of therapy and reduce the number of side effects. Key words: CAR-T, lymphocytes, adoptive immunotherapy, oncology. Онкологические заболевания, несмотря на успехи в лечении и диагностике, по смертности занимают 2-е место после болезней сердечно- сосудистой системы. [1] Эффективность стандартных алгоритмов лечения, включая химиотерапию, хирургию, лучевую терапию, остаётся минимальной. Одним из перспективных направлений в современной онкологии является Журнал «Трибуна ученого» Выпуск 03/2022 https://tribune-scientists.ru 2 иммунотерапия, которая стала прорывным направлением в лечении ряда гематологических опухолей. Концепция иммунологического контроля опухолей впервые была сформирована П. Эрлихом еще в 1909 году, развивалась Ф. Бёрнетом, Л. Томасом. В. Коли использовал неспецифическую стимляцию иммунной системы для терапии сарком. Однако к началу 90-х годов интерес к иммунотерапии у ученых угас, так как клеточная терапии на тот момент представляла собой незначительные попытки применения лимфокинактивированных киллеров (LAK) и инфильтрирующих опухоль лимфоцитов. Эффективность этой терапии ограничивалась узким спектром опухолей у незначительного количества больных. Кроме того, введенные цитокины вызывали серьезные побочные эффекты. К концу 90-х годов появилась таргетная терапия, которая представляла собой применение ритуксимаба [2], после чего началась работа по получению моноклональных антител (монАТ). На сегодняшний день терапевтических монАТ, специфичных к опухолевым антигенам, разрешено около 20 препаратов против 14 мишеней. Однако и эта терапия имеет недостатки: монАТ сами по себе в большинстве случаев не убивают злокачественную клетку, а маскируют её. Когда АТ связываются с опухолевыми клетками, активируется система комплемента и собственные иммунокомпетентные клетки пациента, что и приводит к уничтожению опухоли [3]. Из этого следует, что иммуносупрессия и истощение цитотоксических клеток может значительно снизить эффективность терапии с использованием антител. Позже таргетная терапия была объединена с эффекторной клеткой, вследствие чего появилась адоптивная иммунотерапия T-клетками, которые экспрессировали химерный антигенный рецептор (chimeric antigen receptor – (CAR-T). В 1989 году израильский иммунолог Зелиг Эшхар создал первый в истории химерный рецептор на Т-лимфоцитах, получивших название CAR-T, лимфоциты с усиленным противораковым действием. CAR-T имеют на поверхности встроенную генетическую конструкция – химерный антигенный рецептор, состоящих из конгломератов белков. Одна из 3 Журнал «Трибуна ученого» Выпуск 03/2022 https://tribune-scientists.ru его частей — домены тяжелой и лёгкой цепи иммуноглобулинов(scFv), они связываются с цитоплазмой с помощью цепей и трансмембранных доменов, распознает раковую клетку и связывается с ней, а другая часть отвечает за активацию и регуляцию механизмов, направленных на уничтожение опухолевой клетки. Кроме того, гены, кодирующие scFv получены из В-клеток, а они в свою очередь продуцируют антитела, специфичные к опухолевому антигену. Теперь Т-лимфоцит способен убивать клетку-мишень, либо стимулировать другие иммунные клетки. При помощи Car-t могут реагировать на нативные антигены, расположенные на мембране опухолевой клетки и убивать её. Для усиления эффекта ученые создали уже 3 поколения т-лимфоцитов, которые содержат на себе стимулирующие домены [4]. Основным требованием к мишеням CAR-T, в сравнении с физиологическими Т-лимфоцитами, является экспрессия белка или иного антигена на поверхности злокачественной клетки. Опухолевые антигены можно разделить на группы. Идеальная мишень – это новая белковая последовательность, характерная исключительно для опухолевой линии, например, мутированные варианты эпидермального фактора роста EGFv3 и MUC-1. Наиболее исследованным антигеном-мишенью на сегодняшний день является CD19, который представляет собой линейно-специфичный тканевой антиген, экспрессированный практически на всех этапах дифференцировки В- лимфоцитов, кроме плазматических клеток. CD19 эспрессируется на поверхности опухолевых клеток почти всех В-линейных опухолей. (ОЛЛ, ХЛЛ, В-клеточные неходжскинские лимфомы [5]. Именно с использованием CD19- CAR-Tклеток были получены первые успешные результаты лечения, что позволило перевести технологию в клинические испытания. Применение CAR-T-лимфоцитов. На сегодняшний день СAR-T клеточная терапия показала себя в лечении острого лимфобластного лейкоза, неходжкинскихлимфом, хроническом лимфолейкозе. Это связано с тем, что лимфоциты несут на свое поверхности «линейные антигены», которые в своей экспрессии ограничены лимфоидными 4 Журнал «Трибуна ученого» Выпуск 03/2022 https://tribune-scientists.ru клетками. Кроме лечения гемабластозов существует небольшое количество испытаний с солидными опухолями, где результаты показывают выраженную токсичность при отсутствии значимого терапевтического эффекта. Наиболее успешными являются клинические испытания при лечении нейробластомы, где 3 из 11 пациентов достигли полной ремиссии и лечении саркомы, где у 4 из 17 больных достигнута стабилизация [6]. В зависимости от введения клеточного препарата, результаты терапии отличаются. Например, исследования показали хорошие результаты при введении клеток локально – в опухоль или область, из которой опухоль была удалена хирургически [7]. Побочные эффекты CAR-T терапии Несмотря на эффективность Car-t терапии, имеется ряд побочных эффектов, в виде цитокинового шторма, развития рецидивов после инфузии, непродолжительной пролиферации и персистенции в организме, высокая стоимость производства Т- и так далее. Тем не менее, исследования продолжаются. На сегодняшний день существует 3 основных побочных эффекта при адоптивной иммунотерапии CAR-T лимфоцитами. Самым тяжелым и частым из них является синдром цитокинового шторма, который является серьёзной угрозой жизни х пациентов и требует введения моноклональных антител и Т-клеток, экспрессирующих CAR-T. В основе синдрома цитокинового шторма лежит гиперпродукция провоспалительных цитокинов, источником которых являются сами CAR-T лимфоциты, это ведет к системной воспалительной реакции, что является причиной полиорганной недостаточности и в последующем летального исхода. Клиническими симптомами СЦШ являются: лихорадка, тахикардия, гипотензия, отёки, нарушение сознания, диффузная лимфоаденопатия, гепатоспленомегалия, кожные реакции. Вторым побочным эффектом является нейротоксичность, которая проявляется афазией, нарушением сознания, миоклонусом, судорогами, галлюцинациями. Третьим и очень частым осложнением является В-лимфопения, что обусловлена закономерной деплецией пула нормальных В-лимфоцитов. Это состояние сопровождается гипогаммаглобулинемией, что требует внутривенного введение Журнал «Трибуна ученого» Выпуск 03/2022 https://tribune-scientists.ru 5 иммуноглобулинов. Помимо незначительного терапевтического эффекта, неизбежны и ряд побочных эффектов терапии солидных опухолей: car-t атакуют здоровые ткани сердца, мозга, печени, легких. [8] Производство CAR-T включает в себя несколько этапов. Первым этапом является анаферез лейкоцитов периферической крови пациента. Необходимо собрать не менее 100 х 106 клеток, причем забор крови необходимо делать до химиотерапии. Выделяют отдельные популяции лимфоцитов путем иммуномагнитной селекции и / или депеции моноцитов путем адгезии или элютриации. Далее происходит активация Т-лимфоцитов для последующей экспансии клеток и эффективной трансдукции ретро- и лентивирусными векторами. Чаще всего используется активация с использованием специального реагента – анти- CD3/CD28-антител, иммобилизированных на магнитном носителе разного размера в присутствии интерлейкина 2 или других цитокинов. В 2004 году в своем исследовании Дж. Ким и соавторы предложили активацию CAR-T антиген-презентирующими клетками пациента, а К. Башур и Р. Ларсон рассказывали о растворимом реагенте стипуляции ExpamerTM, после стимуляции которым, Т-клетки легко трансдуцировались специфичной для CD19 конструкцией CAR. Cледующий этап– это генетическая модификация. Сегодня широко применяются гамма-ретровирусные и лентивирусные клетки. В своем исследовании в 2012 году Д.Д Суэрт, А.Шамбах и К.Баум доказали безопасность использования этих вирусов путем наблюдения за пациентами, получавшим терапию модифицированными гамма-ретровирусными Т-лимфоцитами. Лентивирусные векторы теоретически более безопасны, с точки зрения инсерционного мутагенеза и злокачественной трансформации, однако к минусам этого способа относят отсутствие стабильных линий и высокую стоимость. Оба метода дают высокую эффективность и постоянную экспрессию химерного антигена. В январе 2014 года Х.Сингх из университета Техаса предложил новый подход к генетической модификации CAR-T с помощью усовершенствованных Журнал «Трибуна ученого» Выпуск 03/2022 https://tribune-scientists.ru 6 ДНК-векторов, полученных из системы транспозон-транспаза. После электропорации этой модели автор отмечал повышение эффективности интеграции плазмид, используемых для экспрессии CAR-Т. Кроме того, что в отличии от вирусных векторов, по-новому модифицированные клетки обладали большей безопасностью, в исследовании подчеркивался гибкий и экономичный подход к разработке модицифированных Т-клеток, однако клинических испытаний с этими модификациями пока недостаточно. В одном исследовании при создании CAR-Tклеток авторы применили модификацию в виде внедрения гепариназы, которая даёт – лучшую инфильтрацию внутрь опухоли, расщепляет гепариносульфат, являющийся частью межклеточного матрикса, образующего опухолевую строму. Кроме улучшенной инфильтрации, была замечена более высокая противоопухолевая активность CAR-T [9]. Следующим этапом производства является экспансия модифицированных Т-клеток с помощью искусственных антиген-презентирующих клеток К-562, или же с помощью биореакторов, с импользованием цитокинов, поддерживающих пролиферацию T-лимфоцитов – ИЛ-2, ИЛ-7, ИЛ-15. Экспансия в этих случаях поддерживают состав самой среды, температуру и необходимый уровень газов. В 2015 году П. Кумаресан предложил использовать биореактор, который позволяет выполнять правильную последовательность производства: селекция отдельных популяций, трансдукция и экспансия Т-лимфоцитов. Последним этапом производства является контроль - тестирования на безопасность и эффективность, после чего клеточный препарат может вводиться пациенту или быть подвергнут криоконсервации [9]. Известно, что терапия CAR-T может быть токсичной для здоровых клеток. Снижение этого эффекта достигается применением «суицидных систем». Они основаны на введении в геном CAR-T дополнительного модуля с «геномом смерти», продукт которого в присутствии определенных соединений избирательно уничтожает модицифированные лимфоциты, что сводит к минимуму токсичность терапии. Первая система– метаболическая, на основе тимидинкиназы вируса простого герпеса человека и ганцикловира. Вторая – Журнал «Трибуна ученого» Выпуск 03/2022 https://tribune-scientists.ru 7 индоцированая,каспаза iCasp9 плюс инертные, индуцирующие димеризаию соединения, например AP1903. Третья – поверхностные эпиотипы, против которых уже есть доказанные клинически антитела – tEGFR и цетуксимаб, CD20 и ритуксимаб [9]. К сожалению, подавляющее количество подходов, обеспечивающих безопасность CAR-T продуктов, приведенных выше, работают тогда, когда организму уже нанесен ущерб и необходимо быстро остановить развитие процесса. Необходимы дальнейшие исследование и внедрение их в практику, чтобы предотвратить развитие побочных эффектов. Список литературы: 1. Маус М.В., Хаас А.Р., Битти Г.Л. и др. Т-клетки, экспрессирующие химерные антигенные рецепторы, могут вызывать анафилаксию у людей // Рак Иммунол. Рез. 2013. № 1. С. 26–31. 2. Гилл С., Маус М.В., Портер Д.Л. Т-клеточная терапия химерными антигенными рецепторами: 25 лет разработки // Обзоры крови. 2016. № 30(3). С. 157-167. 3. Адусумилли П.С., Черкасский Л., Виллена-Варгас Дж. и др. Регионарная доставка мезотелин-таргетной терапии CAR Т-клетками создает мощный и продолжительный CD4-зависимый опухолевый иммунитет. 2014. 4. Каруана И., Савольдо Б., Хойос В. и др. Гепараназа способствует инфильтрации опухоли и противоопухолевой активности CAR- перенаправленных Т-лимфоцитов. Нац. Мед. 2015. 5. Браун С.Э., Ализаде Д., Старр Р. и др. Регрессия глиобластомы после Т- клеточной терапии химерными антигенными рецепторами. Н. англ. // Дж. Мед. 2016. № 375 (26). С. 2561–259. 6. Павлова А.А. Масчан Адоптивная иммунотерапия генетически модифицированными Т-лимфоцитами, экспрессирующими химерные антигенные рецепторы // ОГ. 2017. №1. 8 Журнал «Трибуна ученого» Выпуск 03/2022 https://tribune-scientists.ru 7. Слейни С.Ю., Кершоу М.Х., Дарси П.К. Транспортировка Т-клеток в опухоли // Рак Рез. 2014. № 74. С. 7168–7174. 8. Калос М., Левин Б.Л., Портер Д.Л. и соавт. Т-клетки с химерными антигенными рецепторами обладают мощным противоопухолевым действием и могут устанавливать память у пациентов с прогрессирующим лейкозом. 2011. № 3 9. Адусумилли П.С., Черкасский Л., Виллена-Варгас Дж. и др. Регионарная доставка мезотелин-таргетной терапии CAR Т-клетками создает мощный и продолжительный CD4-зависимый опухолевый иммунитет. 2014. № 6. Журнал «Трибуна ученого» Выпуск 03/2022 https://tribune-scientists.ru 9